Bij de Beeldenstorm van 1566 zijn een groot gedeelte van het interieur en de vele kerkschatten verloren gegaan. In 1575 kwam de kerk in protestantse handen en veranderde de naam in Hooglandse Kerk. Door economische malaise en de reformatie kwam de grote verbouwing tot stilstand en bleef een onevenwichtig, maar markant kerkgebouw achter. Tijdens het beleg van Leiden werd de kerk opslagplaats voor graan, maar in de 17e eeuw kreeg ze opnieuw een religieuze en maatschappelijke rol in de samenleving. Als gevolg daarvan werden er huizen tegen de kerk aangebouwd, werd er weer in de kerk begraven en vonden er veranderingen plaats aan het interieur. Uit deze periode dateren de kansel, de tochtportalen en de banken in de zijbeuken. Door de ramp met het kruitschip in 1807, economische teruggang en de gestage afname van de bevolking, was de kerk in het midden van de 19e eeuw verworden tot een bouwvallig gebouw en werd sloop overwogen. Uiteindelijk komt het niet zover en vinden er in de volgende eeuwen diverse restauraties plaats.
In de Hooglandse kerk bevinden zich drie orgels. Het grote pijporgel stamt uit 1565 en werd gebouwd door Peter Jansz. de Swart. Oorspronkelijk hing het aan de oostkant van de kerk, maar later werd het verplaatst naar de torenwand. Bij diverse restauraties werd het aangepast en uitgebreid, maar de meeste van deze veranderingenzijn bij de restauratie van 1980 ongedaan gemaakt. Hierdoor is het orgel weer geschikt voor het spelen van oude kerkmuziek. Om ook modernere kerk- en koormuziek te kunnen spelen, werd in 2007 een orgel overgenomen uit de op de nominatie voor sloop staande Sint Mark’s Church in Liverpool. Het derde orgel, een klein kabinetorgel, is afkomstig uit het Heilige Geest Weeshuis in Leiden, het werd in 1959 door de regenten van het weeshuis geschonken aan de kerk. De bouwer is onbekend.

In de kerk zijn een aantal fraaie graven te vinden. Zo is er een rijk versierde grafsteen die eraan herinnert dat Justinus van Nassau, een bastaardzoon van Willem van Oranje en Anna de Merode, in de kerk werd begraven. Een ander rijk versierd graf is de laatste rustplaats van een middeleeuwse kanunnik. Een epitaaf (memoriesteen) is een herinnering aan het feit dat de Leidse burgemeester Pieter van der Werff in 1604 in de kerk werd begraven. Andere bezienswaardigheden in de kerk zijn de preekstoel op een zandstenen voet (1632)en een fragment van het St Pietersaltaar. Het nog werkende uurwerk dat in 2003 uit de toren naar beneden gehaald werd en in de kerk werd geplaatst, dateert uit 1607. Oorspronkelijk was het een uurwerk met spillegang en waag, dat later werd vervagen door een slingeruurwerk.

In de Leidse periode speelde De Hooglandse kerk een belangrijke rol in het leven van de familie Kralt. In 1667 werd Anna van der Laan, de oudmoeder van Aldert Kralt, de dochter van Dirk van der Laan en Geertgen de Jonghe, in deze kerk gedoopt. Zeven van haar 13 broers en zussen zijn eveneens in deze kerk gedoopt: Sara (1659), Cornelis (1660), Joris (1662), Cornelis (1665), Cornelis (1671), Anna (1672) en Joris (1677). Drie van de 6 kinderen van Anna werden ook in deze kerk gedoopt: Jan Kral (1704, de overgrootvader van Aldert Kral (1762), Geertje Kral (1798) en Jacob Kral (1714). De jongste dochter van Jan Kral ( 1704), Trijntje (1750), werd in 1750 in deze kerk gedoopt.